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7月10日(月)・11日(火)、
高等科3年・選択生物の授業(担当:鍋山 航 教諭)で行われた
「pGLOバクテリア遺伝子組み換え実験」を取材しました。

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紫外線を当てると緑色蛍光に光る性質のオワンクラゲから得られた
緑色蛍光タンパク(GFP)の遺伝子を、バクテリアである大腸菌に遺伝子導入します。

大腸菌のコロニーは本来白色ですが、遺伝子組み換えによって性質が変わり
オワンクラゲと同様に紫外線(UV)によって緑色蛍光に光る性質に変化します。

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(図1)今回大腸菌に組み込むプラスミド DNA

学習のテーマは、遺伝子組み換え技術の理解と、
遺伝子発現の制御について学ぶことです。

3時間の座学による原理説明と3時間の無菌操作の練習を経て、
いよいよ遺伝子組み換え当日となりました。

<1日目 遺伝子組み換え操作>

プラスミドDNAと呼ばれる環状DNAを大腸菌に導入しました。
このプラスミドDNA中に緑色蛍光タンパク(GFP)の情報も含まれています。

また、プラスミドDNAを取り込むことに成功した大腸菌だけを選別するため、
プラスミドDNA内には抗生物質であるアンピシリン(amp)耐性遺伝子も含まれています。

本来、大腸菌は抗生物質であるアンピシリン存在下では死んでしまいますが、
プラスミドDNAを取り込むことに成功した大腸菌はアンピシリン入りの培地でも生育可能なため、
この性質を利用して、プラスミドDNAを取り込むことに成功した大腸菌を選別します。

大腸菌とプラスミドDNA溶液を混ぜて、
4℃→42℃(50秒)→4℃
という急激な温度変化(ヒートショック)を与えることで、
大腸菌にDNAを取り込ませます。

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42℃50秒は正確さが求められるため、
生徒たちもタイマーを構え、緊張の面持ちで行いました。

この実験はガスバーナーを使った火炎滅菌という方法での無菌操作で行いましたが、
とても暑くて生徒たちはたいへんでした。

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次に、ヒートショック後の大腸菌を、下図の①~④の4種類のプレートに広げます。
(まる1日培養し、結果は翌日観察します)

<a>
+DNA(DNAを加えた大腸菌)は
LB/amp、LB/amp/ara プレート上で培養します(下の図①、②)。


<b>
-DNA(DNAを加えていない大腸菌)は
LB/amp、LB プレート上で培養します(下の図の③、④)。

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(図2)今回の実験で使用する4種類のプレート

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この実験では、4種類中のプレート①と②に注目します。
(図④は培養が順調であることを確認する為のコントロール=対照実験。)
(図③は抗生物質であるアンピシリン(amp)が、
大腸菌に対して効いていることを示すコントロールです。)

プレート①は、大腸菌のコロニーが生えてくれば遺伝子導入が成功したことになります。
プラスミドDNAを取り込むことができた大腸菌は、抗生物質であるアンピシリン(amp)に対して抵抗性を持ち、
①のアンピシリン入りの培地でも生き残ることができるため、
①にコロニーが得られた場合は遺伝子組換え操作が成功したことになります。

プレート②は、コロニーが得られかつUVランプで緑色蛍光に光れば、
遺伝子組換えが成功し、さらに緑色蛍光タンパク(GFP)つくられたことになります。
②には①に加えてアラビノース(ARA)という糖が入っています。
プラスミドDNA内のGFP遺伝子がはたらくためには、アラビノース(ARA)がスイッチとして必要な物質ですが、
②はアラビノース入りの培地のためGFPが発現し、UVで緑色蛍光に光ることになります。

さて、結果を楽しみに、翌日まで大腸菌を37℃のインキュベーターで1日培養します。

4枚中②のプレート1枚だけ緑色蛍光に光っていれば実験成功です!

<2日目 結果観察>

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写真では見えにくいですが、左から①、②、③、④のシャーレがあり、
紫外線(UV)ランプを照射しています。
予想通り、②のプレートが緑色蛍光に光りました。つまり、緑色蛍光タンパク(GFP)がつくられたことになります。

まとめると、①のプレートには多数のコロニーがありますが白色です。
②のプレートには多数のコロニーがあり、UVランプにより緑色蛍光に光っています。
③のプレートにはコロニーは1つもありません。
④のプレートにはコロニーが多数ありますが白色です。

以上、全てのプレートが予想通りの結果となりました。

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(写真)緑色蛍光のコロニー

生徒のみなさんにとっては、
自分の手を動かしながら科学のおもしろさに触れ、
日ごろの学習内容を再確認する貴重な体験となりました。

高等科3年の選択生物では、1年間を通して
大学の生命科学の分野に直結するような実験を行っています。
次回は、動物組織の超薄切片を作製し、染色していく実験を行う予定です。

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